Affinitätschromatografie

Die Affinitätschromatografie ist ein chromatografisches Trennverfahren zur Isolation eines Analyten aus einer Lösung verschiedener Stoffe. Voraussetzung ist, dass ein geeigneter Ligand (Bindungspartner) zu dem interessierenden Analyten (Protein) zur Verfügung steht. Sie ist eine der leistungsfähigsten Trennmethoden. Die verwendeten Säulen sind jedoch relativ kostspielig, so dass das Verfahren nur in besonderen Fällen beziehungsweise im kleinen Maßstab (Labormaßstab) zum Einsatz kommt.

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Die Trennung erfolgt meist in Säulen, kann aber auch im Batchverfahren vorgenommen werden. Der Reinigungseffekt dieser Methode basiert entweder auf der spezifischen Erkennung eines Proteins durch einen Antikörper oder bei Enzymen auf Ausnutzung der spezifischen Affinität eines Enzyms zu einem Inhibitor, Substrat oder Cofaktor.

Die stationäre Phase (oft ein Gel, z. B. aus quervernetzter Agarose (Handelsname Sepharose^®) wird mit einem geeigneten Liganden (z. B. Antikörper) gekoppelt, der spezifisch den zu reinigenden Analyten bindet. Hierbei ist in der Praxis darauf zu achten, dass die Affinität gegen den Analyten nicht zu hoch ist, da die Elution dadurch erschwert wird. Umgekehrt kann zur präparativen Reinigung von Antikörpern (Immunglobulinen) auch eine stationäre Phase mit einem Protein (meist Protein A, G oder L) verwendet werden, das bestimmte Immunglobulinklassen bindet.

Durchführung

Das Gemisch wird auf die Säule aufgegeben und die interessierende Substanz wird durch die Liganden gebunden. Alle anderen Stoffe verlassen die Säule schnell wieder, da sie mit dem Liganden nicht stark wechselwirken. Nach einem Waschschritt, um unspezifisch gebundene Verunreinigungen zu entfernen, wird der am Liganden gebundene Analyt durch Veränderung der Bedingungen (Pufferzusammensetzung) dazu gebracht, ebenfalls die Säule zu verlassen (Elution). Als Elutionsmittel wird oft ein saurer Puffer oder ein Lösungsmittel/Wasser-Gemisch verwendet (oder Kompetition). Das Eluat enthält den gereinigten und angereicherten Analyten.

Beispiele

Beispiele für Liganden zur Proteinaufreinigung:

Literatur

• Porath, J. et al. (1975): Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. In: Nature. Bd. 258, Nr. 5536, S. 598-599. PMID 1678

Siehe auch

• Protein-tag