Coomassie-Gel

Die Bezeichnung Coomassie-Gel ist die unter Anwendern gebräuchliche Kurzform von „coomassiegefärbtes Polyacrylamid-Gel“.

Man versteht darunter eine gelartige Trägersubstanz, die auf dem Kunststoff Polyacrylamid basiert und bei der elektrophoretischen Trennung von Proteinen Verwendung findet. Die Proteine im Gel werden anschließend mit einem Farbstoff namens Coomassie-Brillant-Blau gefärbt. Solche Gele finden in der biologischen Forschung und medizinischen Diagnostik bei der elektrophoretischen Trennung von Proteinen Verwendung.

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Gel

Das Gel aus Polyacrylamid befindet sich zunächst zwischen zwei rechteckigen Glasplatten und ist 0,5-1,5 mm dick. Polyacrylamid bildet ein mikroskopisches Netzwerk durch das Moleküle wie durch ein dreidimensionales Sieb entsprechend ihrer Größe voneinander getrennt werden können. Im Fall des Coomassie-Gels werden darauf Proteine aufgetrennt. Je kleiner das Protein, desto leichter kommt es durch die Maschen des Polymers und desto schneller kommt es unten an (siehe Gelelektrophorese). Häufig werden Proteine infolge des Auftrennens denaturiert (denaturierende Elektrophorese). Es ist aber auch möglich, eine Coomassiefärbung bei nativen Gelen anzuwenden, bei denen die zu untersuchenden Proteine nach Auftrennung in einer noch nativen Konformation vorliegen.

Die Proben werden oben am Gel in ausgesparte Taschen aufgetragen und eine Gleichspannung angelegt. Proteine einer Größe wandern gleichweit gemeinsam und erreichen auf dem Gel dieselbe Höhe bezogen auf den Startpunkt. Nach Färbung erkennt man waagerechte Striche - je nach Menge auch dicker -, so breit wie die Probentaschen. Dies wird als „Bande“ bezeichnet.

Anfärbung

Nach dem elektrophoretischen Trennvorgang wird der Prozess gestoppt, die Glasplatten entfernt, und das gesamte Gel in Coomassie-Färbelösung gegeben. Diese enthält neben Ethanol oder Methanol, um den Coomassie-Farbstoff in Lösung zu bringen auch eine Säure (meist Essigsäure), um die Proteine im Gel zu fixieren. Als Farbstoff dient Coomassie-Brillant-Blau R-250, dieser lagert sich an basische und aromatische Seitenketten von Aminosäuren (Einzelbausteine der Proteine), und färbt so alle Proteine unspezifisch an (im Gegensatz zum spezifischen Nachweis mittels Western-Blot). Da der Farbstoff generell in das Gel eindringt und damit alles einfärbt, muss man das Gel nach dem Färben wieder größtenteils entfärben. Dies geschieht durch eine Lösung, die alle Komoponenten der Färbelösung bis auf den Farbstoff selbst enthält. Nach einer gewissen Zeit werden erst dann die Proteine als blaue Banden auf dem Gel sichtbar.

Anwendung

• Die Färbung mit Coomassie ist die Standard-Methode um Proteine im Polyacrylamid-Gel sichtbar zu machen. Sie ist einfach und semi-quantitativ, hat aber eine untere Nachweisgrenze (ca. 100 ng/Bande). Für den Nachweis von Proteinen, die in geringeren Mengen vorhanden sind, ist die Silberfärbung hierfür besser geeignet. Dort liegt die Nachweisgrenze bei ca. 0,1 bis 1 ng pro Bande.

• Eine weitere Anwendung coomassiegefärbter Gele ist die schnelle Überprüfung, ob in entsprechenden Proteintaschen ungefähr jeweils gleichviel Gesamtprotein aufgetragen wurde (Ladekontrolle). Jedoch ist ein Westernblot hierfür wesentlich spezifischer und damit besser geeignet.

Coomassie-Lösungen

Hier ist ein Beispiel, wie die beiden Lösungen für das Anfärben und Entfärben zusammengesetzt sein können. Es kann als Richtschnur dienen.

• Coomassie-Färbelösung

0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250

50 % (v/v) Methanol

7 % (v/v) Essigsäure

• Entfärbelösung

20 % (v/v) Methanol

7 % (v/v) Essigsäure

Methanol kann dabei durch Ethanol ersetzt werden (einfachere Entsorgung).

Siehe auch

• Western Blot
• Silberfärbung