Proteinkristall

Ein Proteinkristall ist der Untersuchungsgegenstand der Proteinkristallographie und besteht aus gereinigtem Protein und großen Anteilen von Wasser.

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Geschichte

Während man bei Kristallen von einfach gebauten chemischen Verbindungen mit der noch jungen Methode der Röntgenstrukturanalyse relativ rasch die Struktur aufklären konnte (NaCl 1913, Benzol 1928), traten große experimentelle Schwierigkeiten bei Proteinen auf, da diese aus tausenden Atomen bestehen. Die erste Schwierigkeit war die Isolierung, Reinigung und Kristallisation von Proteinen. Dies gelang James Batcheller Sumner erstmals bei dem Enzym Urease 1926 und bei den Proteinen Concanavalin A und B aus der Schwertbohne. Die Anwendung der Proteinkristallisation als allgemeine Methode konnte John Howard Northrop z. B. anhand des Pepsins 1929 zeigen. Beide Forscher erhielten für diese Entwicklungen im Jahre 1946 den Nobelpreis für Chemie.

Erst Anfang der 1930er-Jahre gelang es dem britischen Physiker, Kristallographen und Wissenschaftshistoriker John Desmond Bernal und seiner Mitarbeiterin Dorothy Crowfoot Hodgkin (die 1964 alleine den Nobelpreis für Chemie erhielt), von Proteinkristallen scharfe Beugungsbilder zu erhalten. Um aus diesen Beugungsbildern die dreidimensionale Proteinstruktur zu ermitteln, war jedoch ein großer rechnerischer Aufwand erforderlich, der erst mit der Entwicklung des Computers in den 1960er Jahren einfacher zu bewältigen war. Die erste Struktur eines Proteins (Myoglobin) wurde von Max Perutz und John Cowdery Kendrew mit Hilfe der Röntgenkristallographie 1959 aufgeklärt (gemeinsamer Nobelpreis für Chemie 1962). Mittlerweile sind Zehntausende von Proteinen und Proteinkomplexen (sogar Ribosomen oder Viren) kristallisiert und strukturell charakterisiert worden (siehe Weblink RCSB-PDB).

Eigenschaften

Proteinkristalle entstehen nur sehr selten im Zytoplasma, kristalline Virenaggregate sind häufiger zu finden. Das Kristallwasser der Proteinkristalle nimmt etwa 30 - 70 % des Kristallvolumens ein und liegt teilweise in quasi-flüssiger Form in den Hohlräumen zwischen den Proteinmolekülen vor. Proteinkristalle sind daher im Vergleich zu Ionen- oder Molekülkristallen sehr viel empfindlicher, was sowohl den Wasserverlust, als auch die schlechten mechanischen Eigenschaften betrifft (beispielsweise die sehr geringe Härte). Die großen Hohlräume zwischen den Proteinmolekülen lassen sich durch die Tatsache veranschaulichen, dass z. B. ein farbloser Lysozym-Kristall durch Zugabe von Methylenblau durchgehend blau gefärbt wird, den Farbstoff aber, nach Überführung in ein farbstofffreies Medium, langsam wieder durch Diffusion freisetzt (analog zu Zeolithen). Diese Eigenart von Proteinkristallen nutzt man auch in der Aufklärung der Proteinstruktur durch Kristallstrukturanalyse mittels Röntgenbeugung, indem man Schweratomderivate (z. B. Uran, Quecksilber u. a.) durch Einlegen der Kristalle in entsprechende Schwermetallsalzlösungen herstellt. Aufgrund der chiralen Natur der natürlich vorkommenden Proteine kristallisieren sie nur in bestimmten symmetrischen Anordnungen, die durch die 65 enantiomorphen oder chiralen Raumgruppen beschrieben werden (diese weisen keine Spiegeleben oder Inversionszentren auf).

Herstellung

Um ausreichend Protein zu erhalten, werden heute Proteine häufig zuerst überexpremiert (zumeist in E. coli oder Hefe), da die Aufreinigung der Proteine wesentlich einfacher ist und man auch sehr leicht an große Mengen an Protein gelangen kann.

Die Grundvorraussetzung zur Herstellung von Proteinkristallen sind ausreichende Mengen an hochreinem Protein (Proteine kann man mittels Kombination von Fällungsmethoden, Chromatographie oder präparativer Elektrophorese von anderen Proteinen trennen). Die Kristallisations-bedingungen findet man anschließend, indem man hochkonzentrierte Proteinlösungen (ca. 2 - 20 mg Protein/ml) mit verschiedenen Puffer-Lösungen, die zumeist sehr hohe Konzentrationen an Salzen (z.B. Ammoniumsulfat), Alkoholen (z.B. Ethanol und Methylpentandiol) oder Polyethylenglykol (PEG) enthalten, in kleinen Tropfen mit Volumina im Nano- bis Mikroliterbereich vermischt und über Tage bis Wochen und Monate bei konstanter Temperatur stehen lässt.

Für die Kristallstrukturaufklärung benötigt man Einkristalle (entsprechenden Kristalle sind auf den Fotos 1 und 2 abgebildet) - viel häufiger jedoch als diese entstehen ein amorpher Niederschlag (Präzipitat) oder auch Kristalle, die nicht für eine derartige Untersuchung geeignet sind (Fotos 4 und 5). Sobald auch nur kleine Proteinkristalle wachsen, ist das ein großer Erfolg, denn anschließend können die Kristallisationsbedingungen optimiert werden. Für die Löslichkeit entscheidende Parameter sind der pH-Wert, "salting in", "salting out", Ionenstärke, organische Lösungsmittel (Dielektrizitätskonstante) und die Temperatur. Dabei sollten die Kristallisationsparameter bei unterschiedlichen Temperaturen getestet werden. Allerdings gibt es auch einige Proteine, die sich nicht kristallisieren lassen, darunter bisher die meisten Membranproteine.

Gelegentlich beobachtet man bei seinen Kristallisationsansätzen auch die Bildung von recht eigenartigen Kristallen, wie zum Beispiel eines Schmetterlingkristalls (Foto 5).

Analyse

Potentielle Proteinkristalle werden vor der Untersuchung im Röntgendiffraktometer meist in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann in einem Gasstrom bei ca. -170 ºC montiert, um die Schäden am Proteinkristall durch die Wechselwirkung mit der Röntgenstrahlung zu verringern. Streuende Kristalle bedeuten noch nicht, dass es sich um Proteinkristalle handelt, da aus den Puffer-Lösungen auch häufig Salze auskristallisieren. Diese kann man aber durch Untersuchung mittels eines Röntgendiffraktometers von Protein-Kristallen unterscheiden, denn beide erzeugen sehr typische, unterschiedliche Streubilder.

Für die Untersuchung mittels Röntgenbeugung sind aber so genannte Einkristalle hoher Qualität und Reinheit erforderlich, deren Herstellung sehr aufwendig ist. Daher finden heutzutage vermehrt High-throughput screening bzw. automatisierte Methoden in Forschung und Industrie Anwendung, um eine große Anzahl von Proteinen zu reinigen und um Kristallisationsbedingungen zu testen. Manche Messtationen (Beamlines) an Synchrotronanlagen, die mit hochintensiver Röntgenstrahlung arbeiten, sind inzwischen mit Robotern ausgerüstet, welche das Diffraktionsverhalten von Proteinkristallen analysieren, geeignete Exemplare für die Strukturaufklärung auswählen und gegebenenfalls vollständige Diffraktionsdatensätze messen.