QPNC-PAGE

QPNC-PAGE (Abkürzung für engl.: quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis) ist eine spezielle Variante der Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie und Bioanorganischen Chemie zur Trennung von Molekülen im elektrischen Feld. Diese hochauflösende Trennmethode dient zur quantitativen Abtrennung und Isolierung von biologisch aktiven Metalloproteinen aus komplexen biologischen Matrizes, wobei es sich um menschliche, pflanzliche oder tierische Proben handeln kann.

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Elektrophoresepuffer und Gel

Als kontinuierlicher Elektrophoresepuffer wird bei QPNC-PAGE eine spezielle Pufferlösung, eine Mischung aus 20 mM Tris-HCl und 1 mM NaN₃, mit dem pH-Wert 10,00 gewählt. Kontinuierlich bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sowohl der Anodenpuffer, als auch der Kathodenpuffer sowie der Puffer zur Herstellung des Polyacrylamid-Gels die gleiche chemische Zusammensetzung und Konzentration haben. Die meisten Proteine eines lebenden Organismus sind bei dem pH-Wert von 10,00 negativ geladen und wandern im elektrischen Feld daher von der Kathode zur Anode.

Das Polyacrylamid-Gel muss auf Grund der technischen Vorgaben der verwendeten Elektrophoresekammer vor jedem Lauf frisch hergestellt werden. Die Herstellung erfolgt prinzipiell so, wie es bereits in dem Artikel Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschrieben ist. Das fertige Gel verfügt über eine großporige Struktur mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% T (T = Gesamtanteil von Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid im Gel [w/v]) mit einer Quervernetzung von 2,7 % C (C = Verhältnis N,N-Methylenbisacrylamid/Acrylamid [w/w]). Es verfügt über eine Höhe von 40 mm mit einem inneren Durchmesser von 28 mm. Der Anteil an TEMED als Polymerisierungs-Katalysator beträgt 0,05 % (v/v), der Anteil an APS als Radikalstarter 0,5 % (v/v). Weitere Details zur Herstellung sind in den angegebenen Quellen veröffentlicht.

Das Gel benötigt insgesamt 69 h Stunden zur vollständigen Polymerisation bei Raumtemperatur. Dieses Vorgehen bewirkt, dass sich keine freien Monomere mehr im Gel befinden, wodurch Reaktionen von Gelkomponenten mit den zu isolierenden Analyten ausgeschlossen werden können. Das Gel ist mechanisch stabil und lässt sich gut handhaben. Die elektrophoretische Trennung von Biomakromolekülen findet unter Kühlung in einer speziellen Elektrophoresekammer bei 4° C statt.

Trenneigenschaften und Quantifizierung

Die Eigenschaften des standardisierten Verfahrens der QPNC-PAGE bewirken, dass bei einem elektrophoretischen Lauf weder die Größen (Molekülmassen) noch die Formen (Gestalt) der zu isolierenden Proteine eine Trennung beeinflussen. Stattdessen erfolgt die Isolierung der aufgetrennten Proteine (Metalloproteine, Proteine mit organischen Cofaktoren und ohne Cofaktoren) und Peptide ausschließlich entsprechend den isoelektrischen Punkten (pI).

Die aufgetrennten Moleküle wandern jeweils mit unterschiedlich konstanter Geschwindigkeit als ringförmige Proteinbanden durch das Gel und werden dann kontinuierlich von einem physiologischen Puffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN₃, pH-Wert 8,00) eluiert. Bei einer Trennung werden weder die vorliegenden Metall-Proteinkomplexe dissoziiert noch die nativen Konformationen verändert. Das Auflösungsvermögen der QPNC-PAGE für Metallcofaktoren (z.B. Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr oder Cd), die in verschiedenen Fraktionen gesammelt werden, bewegt sich im physiologisch wirksamen Bereich von ungefähr 1 ng/mL.

Molekularsiebeffekte oder sonstige Interaktionen der Gelmatrix mit den Analyten können auf Grund der Porengröße und Homogenität des Gels als vernachlässigbar gering eingestuft werden. Molekularsiebeffekte können bedeuten, dass Moleküle nach Größe aufgetrennt werden oder ihre Gestalt verändert wird. Ebenso finden während einer Trennung systembedingt keine Wechselwirkungen mit dem Elektrophoresepuffer statt. Diese Eigenschaften unterscheiden die QPNC-PAGE fundamental von der Nativ-Gelelektrophorese. Nach einer Identifizierung und Quantifizierung der Metallcofaktoren mit der ICP-MS (Abkürzung für engl.: inductively coupled plasma mass spectrometry) kann ein isoliertes Metallprotein aufgrund seiner hohen Reinheit und optimierten Konzentration der NMR-Spektroskopie zugeführt werden. Näheres zum Thema der Identifizierung und Quantifizierung von Metalloproteinen findet sich in den angegebenen Quellen wieder.

Einsatzgebiete

Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie können ein- oder mehrdimensionale Proteinstrukturen in bestimmten PAGE-Fraktionen von nativen und denaturierten Metall-Proteinen aufgeklärt und mit Hilfe der Bioinformatik Struktur-Funktionsbeziehungen für bestimmte Metalloproteine (z.B. Metallochaperone, Prionen, Metalloenzyme, u.a.) ermittelt werden. Besonders wichtig ist dieser Ansatz für die klinische Diagnostik und Therapie im Bereich von Krankheiten, deren Ursprung eine Fehlfaltung der Proteine ist, wozu beispielsweise Alzheimersche Krankheit, Parkinson-Krankheit, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und verschiedene Krebserkrankungen zählen.

Literatur

• B. Kastenholz: New hope for the diagnosis and therapy of Alzheimer's disease. In: Protein Pept. Lett. 14, 2007, S. 389-393.[1]

• B. Kastenholz: Important contributions of a new quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC-PAGE) procedure for elucidating metal cofactor metabolisms in protein-misfolding diseases – a theory. In: Protein Pept. Lett. 13, 2006, S. 503-508. Special issue [Hot Topic: Recent Advances in Protein and Peptide Chemistry Related to Cellular Regulation (Guest Editor: John W. Ho)]. [2]

• B. Kastenholz: Comparison of the electrochemical behavior of the high molecular mass cadmium proteins in Arabidopsis thaliana and in vegetable plants on using preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE). In: Electroanalysis 18, 2006, S. 103-106.[3]

• B. Kastenholz: Preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE): An efficient method for isolating cadmium cofactors in biological systems. In: Anal. Lett. 37, 2004, S. 657-665.[4]

• B. Kastenholz: QPNC-PAGE, NMR und Alzheimer - Verfahren zur Isolierung und Aufklärung bioaktiver Metallproteine. In: GIT Laborfachzeitschrift 6, 2006, S. 550.[5]