Durch Lichtverformung können 2D-Mikroskope 4D-Daten erfassen
Neue Methode erweitert die Fluoreszenzmikroskopie um eine neue Dimension
Forscher der Rice University haben der revolutionären Technik eine neue Dimension hinzugefügt, die die Möglichkeiten von Standardlabormikroskopen erweitert.
Forscher der Rice University haben eine Methode entwickelt, um individuelle Masken zu erstellen, die 2D-Fluoreszenzmikroskopie-Bilder in 3D-Filme verwandeln.
Landes Research Group/Rice University
Vor zwei Jahren führte das Rice Lab der Chemikerin Christy Landes die Superzeitauflösungsmikroskopie ein, eine Technik, die es Forschern ermöglichte, fluoreszierende Moleküle 20 mal schneller abzubilden, als es herkömmliche Laborkameras normalerweise erlauben. Sie haben nun eine allgemeine Methode entwickelt, mit der ein Mikroskop 3D-Rauminformationen zusammen mit der vierten Dimension, der molekularen Bewegung im Laufe der Zeit, erfassen kann.
Dies, so sagen sie, wird Wissenschaftlern, die dynamische Prozesse studieren, helfen, zu sehen, wo sich die interessanten Moleküle befinden und wie schnell sie sich bewegen - zum Beispiel in lebenden Zellen.
Die Rice Methode zur Erweiterung der Fähigkeiten bestehender Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskope ist im Open-Access-Paper des Teams erläutert.
Es beschreibt die Erstellung von benutzerdefinierten Phasenmasken: transparente, rotierende Scheiben, die die Lichtphase manipulieren, um die Form des von der Kamera des Mikroskops aufgenommenen Bildes zu verändern. Die Form enthält Informationen über die 3D-Position eines Moleküls im Raum und das zeitliche Verhalten im Sichtfeld der Kamera.
Eine Phasenmaske macht das, was wie eine Unannehmlichkeit erscheint, den verschwommenen Fleck in einem Mikroskopbild, zu einem Gewinn. Wissenschaftler geben diesem Blob einen Namen - die Punktverteilungsfunktion - und verwenden ihn, um Details über Objekte unterhalb der Beugungsgrenze zu erhalten, die kleiner sind, als alle sichtbaren Lichtmikroskope sehen können.
Die ursprüngliche Arbeit verwendete eine rotierende Phasenmaske, die das Licht eines einzelnen fluoreszierenden Moleküls in eine so genannte rotierende Doppelhelix umwandelte. Das aufgenommene Bild erschien auf der Kamera als zwei leuchtende Scheiben, wie die Lappen einer Langhantel. In der neuen Arbeit ließen die rotierenden Langhanteln sie nicht nur sehen, wo sich Moleküle im dreidimensionalen Raum befinden, sondern gaben jedem Molekül auch einen Zeitstempel.
Das Herzstück der neuen Arbeit sind Algorithmen von Hauptautor und Rice Elektro- und Informatik-Absolvent Wenxiao Wang. Die Algorithmen machen es praktisch, benutzerdefinierte Phasenmasken zu entwerfen, die die Form der Punktverteilungsfunktion verändern.
"Mit der Doppelhelix-Phasenmaske wurden die Zeitinformationen und die räumlichen Informationen verbunden", sagte Co-Autor Chayan Dutta, Postdoc-Forscher im Labor von Landes. "Die Drehung der Lappen könnte entweder den 3D-Raum oder schnelle Zeitinformationen ausdrücken, und es gab keine Möglichkeit, den Unterschied zwischen Zeit und Raum zu erkennen."
Bessere Phasenmasken lösen dieses Problem, sagte er. "Das neue Phasenmasken-Design, das wir eine Stretching-Lobe-Phasenmaske nennen, entkoppelt Raum und Zeit", sagte Dutta. "Wenn sich die Ziele in verschiedenen Tiefen befinden, dehnen sich die Lappen weiter auseinander oder kommen näher, und die Zeitinformation wird nun nur noch in der Rotation kodiert."
Der Trick besteht darin, das Licht an der rotierenden Phasenmaske zu manipulieren, um das Muster für verschiedene Tiefen zu optimieren. Dies wird durch das vom Algorithmus in die Maske programmierte Brechungsmuster erreicht. "Jede Schicht ist im Algorithmus für unterschiedliche Erkennungstiefen optimiert", sagt Diplomanden und Co-Autor Nicholas Moringo. "Wo wir früher Objekte in zwei Dimensionen im Laufe der Zeit sehen konnten, können wir jetzt alle drei räumlichen Dimensionen und das schnelle Zeitverhalten gleichzeitig sehen."
"Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskope werden in vielen Bereichen eingesetzt, insbesondere in der Zellbiologie und der medizinischen Bildgebung", sagte Landes. "Wir fangen gerade erst an zu zeigen, wie die Manipulation der Lichtphase in einem Mikroskop eine relativ einfache Möglichkeit ist, die Raum- und Zeitauflösung zu verbessern, verglichen mit der Entwicklung neuer Fluoreszenz-Tags oder der Entwicklung neuer Hardware-Verbesserungen."
Ein wichtiges Ergebnis, das breiten Anklang finden könnte, sagte sie, ist, dass die Forscher das Phasendeckendesign verallgemeinert haben, so dass Forscher Masken herstellen können, um praktisch jedes beliebige Muster zu erzeugen. Um dies zu demonstrieren, entwarf und fertigte die Gruppe eine Maske, um eine komplexe Punktverteilungsfunktion zu erstellen, die RICE in verschiedenen Tiefen darstellt. Ein Video zeigt die geisterhaften Buchstaben, die erscheinen und verschwinden, wenn sich das Mikroskop in verschiedene Tiefen über und unter der Fokusebene bewegt.
Diese Flexibilität wird für Anwendungen wie die Analyse von Prozessen in lebenden Krebszellen nützlich sein, ein Projekt, das das das Labor in Kürze mit Partnern des Texas Medical Center durchführen möchte.
"Wenn Sie eine Zelle auf einem Glasobjektträger haben, werden Sie verstehen können, wo Objekte in der Zelle in Beziehung zueinander stehen und wie schnell sie sich bewegen", sagte Moringo. "Kameras sind nicht schnell genug, um alles zu erfassen, was in einer Zelle passiert, aber unser System kann es."
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